Toxikologisk säkerhetsvärdering av läkemedel - reproduktion

Missbildningar hos nyfödda har i alla tider skrämt, fascinerat och upprört människor. Insikten om att yttre agens kan vara orsaken är dock relativt ny. Placentan betraktades länge som en "barriär" som skyddade fostret från påverkan av läkemedel och andra kemiska ämnen. Att detta inte stämmer och att människofoster kan skadas av läkemedel som modern tagit under graviditeten stod helt klart i början av 60-talet då sambandet mellan främst extremitetsmissbildningar och talidomid (Neurosedyn) fastställdes. Ungefär 3% av nyfödda barn har allvarliga medfödda defekter, de allra flesta beroende på genetiska störningar. Även om kemiska ämnen och andra miljöfaktorer bevisligen kan orsaka missbildningar är deras bidrag till den totala incidensen mycket litet.

Av de cirka 900 aktiva substanser som ingår i läkemedlen i FASS är ett trettiotal (drygt 3%) påvisat eller misstänkt missbildningsframkallande hos människa. Bland dessa märks t ex retinoider (hjärn- och ansiktsskador, tymushypoplasi, hjärt-kärlmissbildningar), antiepileptika (läpp-gomspalt av hydantoinderivat, ryggmärgsbråck av valproinsyra), kumarinderivat (t ex warfarininducerad kondrodystrofi), sexualhormoner och vissa antibiotika. Antalet "potentiella" kemiska teratogener, inklusive läkemedel, dvs ämnen som gett missbildningar i djurförsök, är betydligt större. Hittills har mer än 3 300 kemiska ämnen testats och en dryg femtedel av dessa var teratogena i flera species.

Före talidomidkatastrofen förekom ingen regelrätt testning av läkemedels möjliga reproduktionstoxikologiska effekter. Katastrofen ledde snabbt till krav på studier av reproduktionstoxicitet för godkännande och registrering. Även om teratogena effekter är vad de flesta tänker på som "reproduktionstoxicitet" omfattar testerna inte bara studier av missbildningsframkallande effekter utan också effekter på fertilitet och reproduktionsförmåga liksom studier av effekter på avkomman om modern ges läkemedlet under sen graviditet och under laktationen (peri/postnatala effekter).

Vilka läkemedel studeras och när?

I princip ska alla nya läkemedels reproduktionstoxikologiska effekter studeras. Vilka slags studier som krävs styrs dock till viss del av den tilltänkta patientgruppen. Om ett läkemedel bara ska ges till män eller postmenopausala kvinnor kan studier av teratogena effekter och effekter på peri/postnatal utveckling vara onödiga. Om kvinnor i fertil ålder ska ingå i klinisk prövning eller avses behandlas krävs studier av effekter på fertilitet hos hondjur och embryo-fetal utveckling redan före första tillförsel till människa (kliniska fas I-prövningar). Effekter på fertilitet hos handjur klarläggs dels i studier av toxicitet vid upprepad tillförsel av läkemedlet med histopatologi av reproduktionsorganen (före fas I- eller II-prövningar) och dels i en fertilitetsstudie med parning mellan behandlade hanar och obehandlade eller behandlade honor (före klinisk fas III-prövning). Effekter under peri/postnatalperioden ska vara kända vid ansökan om godkännande för marknadsföring.

Hur görs reproduktionstoxikologiska studier?

Segment I-, II- och III-studier

Uppläggningen och utförandet av reproduktionstoxikologiska studier av läkemedel följer fortfarande oftast de riktlinjer som fastställdes av Food and Drug Administration i USA i mitten av 60-talet och vilka sedan kommit att gälla i flertalet länder. Enligt dessa riktlinjer studeras effekter under tre olika reproduktionsstadier - fertilitet och reproduktionsförmåga (Segment I), embryotoxicitet och teratogenicitet (Segment II) samt peri- och postnatal utveckling (Segment III). Studierna utförs i regel på råtta (Segment I), råtta/mus och kanin (Segment II) samt råtta (Segment III). Att just dessa djurslag används beror främst på god tillgänglighet, välkänd reproduktionsfysiologi, stora kullstorlekar och kort dräktighetstid (mus 19-20 dagar, råtta 22 dagar, kanin 32 dagar).

Normalt används tre dosnivåer. Den högsta dosen ska ge viss toxicitet (mätt som t ex minskad kroppsviktsökning) och den lägsta ska ge en farmakologisk effekt motsvarande den som ses i kliniken eller samma systemexponering som i kliniken. Läkemedlet ska helst administreras till djuren på samma sätt som till människa.

I en Segment I-studie behandlas djuren under gametogenesen (60 dagar för hanråtta, två veckor för honråtta) och under parning. Vanligen fortsätter behandlingen även under dräktighet, förlossning och laktation fram till avvänjning, varför en Segment I-studie ger en viss vägledning inför studier av effekter på andra stadier av reproduktionen. Oftast paras behandlade hanar med behandlade honor. Om några effekter ses ska studien upprepas med behandlade hanar/obehandlade honor och obehandlade hanar/behandlade honor. Några dagar före partus avlivas hälften av honorna och fostren tas ut med kejsarsnitt. Antalet gulkroppar, implantationer och resorptioner (råttans motsvarighet till spontanabort) räknas. Fostren vägs och könsbestäms samt undersöks med avseende på yttre och inre (skelett och viscerala) missbildningar. Den andra hälften av honorna får föda sina ungar. Påverkan på förlossningen noteras och ungarna undersöks (levande/döda, kön, vikt, yttre missbildningar). Ungarnas utveckling följs fortlöpande. Effekter på syn, hörsel och beteende bör studeras. När ungarna nått vuxen ålder undersöks deras reproduktionsförmåga genom att minst en hane och en hona från varje kull paras och avkomman undersöks ett par dagar före partus.

I en Segment II-studie behandlas dräktiga djur under organogenesen. Denna period upptar en mycket större del av dräktighetstiden hos mus och/eller råtta (dräktighetsdagarna 6-15) och kanin (dräktighetsdagarna 6-18) än hos människa (dag 21-58). I Segment II-studier avlivas alla djur 1-2 dagar före väntad partus och för varje djur fastställs antal gulkroppar, levande och döda foster, implantationer och resorptioner. Fostren könsbestäms, vägs och undersöks på förekomst av yttre och inre missbildningar och skelettanomalier.

I en Segment III-studie behandlas dräktiga råttor under den sista tredjedelen av dräktigheten och under laktationen, dvs. från dag 15 av dräktigheten t o m dag 21 post partum. Ungarna får framfödas spontant. Effekter på partus och laktation, moderns sätt att ta hand om ungarna och effekter på ungarna (vikt, kullstorlek, antal döda/levande, yttre missbildningar) observeras. Liksom i Segment I-studier brukar sena effekter på syn, hörsel och beteende studeras liksom ungarnas fortplantningsförmåga.

Studier enligt ICH

En riktlinje för reproduktionstoxikologiska studier har nyligen utarbetats inom det internationella harmoniseringsarbetet med toxicitetstestning av läkemedel (ICH; International Conference on Harmonisation). Riktlinjen förespråkar hög flexibilitet vid uppläggning av studierna. Som huvudprincip gäller att alla relevanta stadier av reproduktionsprocessen ska omfattas, antingen via studier under definierade perioder eller i en- eller tvågenerationsstudier. De relevanta stadierna är: A) före parning till befruktning, B) från befruktning till implantation, C) från implantation till gomslutning, D) från gomslutning till dräktighetens slut, E) från födelse till avvänjning, F) från avvänjning till sexuell mognad. Riktlinjen nämner dock att den "traditionella" kombinationen av tre studier (fertilitet/tidig embryonal utveckling, embryo-fetal utveckling samt peri/postnatal utveckling) torde vara adekvat för de flesta läkemedel.

ICH-riktlinjen ger anvisningar som bygger på dagens kunskaper om reproduktionstoxikologi och krav för säkerhetsvärdering. Om jämförande farmakologi och kinetik visat att en djurart är en bra modell för människa så anses ett species vara tillräckligt för reproduktionstoxikologiska studier. Risken för falskt positiva resultat i reproduktionsstudier är jämförelsevis hög, eftersom det finns en uttalad normal variation i reproduktionsparametrar hos försöksdjur. Riktlinjen betonar därför också starkt betydelsen av ett korrekt dosval med samtidigt beaktande av kinetikdata för att ett tillförlitligt exponerings-responssamband ska kunna fastställas. Enligt ICH-riktlinjen räcker oftast en kortare behandlingstid (2-4 veckor) för att fånga upp påverkan på fertiliteten hos råtthanar än den långa (60 dagar, vilket täcker hela spermatogenesen) behandlingstid som traditionellt rekommenderats. Mycket få substanser visar selektiva effekter på hanlig reproduktion och om så är fallet påverkas oftast postmeiotiska stadier. Histopatologi av testiklar är det säkraste sättet att fastställa effekter på spermatogenesen. Sådana undersökningar är rutin i "vanliga" toxicitetsstudier med upprepad administration, varför dessa många gånger ger bättre information om effekter på hanens fertilitet.

Multigenerationsstudier

I multigenerationsstudier behandlas minst två generationer försöksdjur (oftast används råtta) kontinuerligt. Multigenerationsstudier används sällan för att studera läkemedels reproduktionseffekter, utan anses ha ett större värde för studier av kemiska ämnen där exponeringen är låg och många gånger livslång, t ex livsmedelstillsatser och miljögifter. En multigenerationsstudie är mycket tidskrävande (tar minst ett år) och "svårhanterlig" på grund av det mycket stora antalet djur som måste hanteras och observeras. Multigenerationsstudier är dock mycket användbara för att fastställa nolleffektdoser, vilket är särskilt eftersträvansvärt för riskbedömning av t ex miljögifter. De anses också ha vissa fördelar jämfört med "segmentstudier". Sålunda omfattar multigenerationsstudier även effekter på mycket tidiga stadier av oogenesen, anses vara bättre för att studera störningar i placentafunktionen och eliminerar alla osäkerheter vad gäller exakta tidpunkter för implantationen och organogenesens början och slut.

Mekanismer och allmänna principer för teratogenicitet

Utan att vara direkt missbildningsframkallande kan flera grupper av läkemedel, t ex perorala diabetesmedel, tyreostatika, salicylsyraderivat och blodtryckssänkande medel ge skadliga effekter på foster och nyfödda via farmakologiska mekanismer. Mekanismerna för induktion av missbildningar är dock fortfarande till mycket stor del okända. Svårigheterna att fastställa mekanismer för teratogenicitet beror sannolikt på den oerhörda komplexitet som karakteriserar embryonal och fetal utveckling. Teoretiskt är många typer av interaktioner mellan teratogena agens och cellulära funktioner och processer möjliga. Till dessa hör påverkan på det genetiska materialet (mutationer, störd cellreplikation eller störd nukleinsyrametabolism eller -funktion), minskad tillgång på nödvändiga prekursorer och substrat, minskad energitillförsel, störningar i membranfunktioner och elektrolytbalans samt enzyminhibition. Alla dessa fenomen antas kunna utlösa flera patogena svar hos embryot såsom minskad cellproliferation med försämrad tillväxt, ändrade vävnadsinteraktioner med störd differentiering, minskad biosyntes, inhibition av morfogenetiska rörelser och störd normal degeneration (apoptos).

Trots bristen på kända mekanismer gäller flera väletablerade vetenskapliga principer för embryo- och fosterskadande ämnens effekter. Utvecklingsstörningar in utero manifesteras i huvudsak på fyra olika sätt: tillväxthämning, funktionella störningar, missbildningar och död. Förhållandet mellan dessa fenomen är komplext och varierar med typ av ämne, tidpunkt för exponering och dosens/exponeringens storlek. För vissa ämnen ses de fyra effekterna i denna ordning med ökande frekvens med ökande exponering, dvs effektens natur visar ett uttalat dosberoende. På grund av hög reparativ potential, cellulära homeostatiska mekanismer och maternala metaboliska försvarsmekanismer finns vanligen doströsklar för flertalet fosterskadande kemiska och fysikaliska faktorer, dvs vid låga exponeringar ses ingen effekt alls.

Karakterisktiskt för teratogener är också att tidpunkten för deras tillförsel har mycket stor betydelse för effekten - man brukar tala om olika känslighetsperioder. Exponering under perioden befruktning - implantation ger i de allra flesta fall en "allt-eller-intet"-effekt. Under organogenesen är känsligheten för strukturella missbildningar allra högst. Varje vävnad/organ har sin egen maximalt känsliga period. Ett givet ämne kan dessutom orsaka olika typer av skador vid olika tidpunkter. Efter organogenesen och fram till födelsen har fostret hittills trotts vara relativt okänsligt. Under den fetala perioden sker främst tillväxt, men även en viss fortsatt differentiering av celler och vävnader samt fysiologisk "mognad", speciellt av CNS. I synnerhet funktionella störningar och beteendestörningar tros kunna induceras under denna period.

Prediktivt värde?

Embryogenes och fetal utveckling visar relativt stora likheter hos olika däggdjur. Placentans uppbyggnad varierar markant mellan olika djurslag, men dessa olikheter förefaller inte ha någon större betydelse för läkemedels placentapassage. Avkomman till de mest använda laboratoriedjuren är mer outvecklad än hos människa. Detta beror främst på att den fetala perioden är mycket kort hos mus och råtta (20% av dräktighetstiden) jämfört med människa (över 75% av graviditetstiden). Hos mus och råtta sker t ex tillväxt och mognad av CNS huvudsakligen efter födelsen, men hos människa både före och efter födelsen. Effekter på CNS hos människa vid tillförsel under sen graviditet kan därför anses motsvaras av postnatal tillförsel av läkemedel till mus och råtta.

Tolkning och extrapolering av resultat från reproduktionsstudier, i synnerhet Segment II-studier, anses ofta vara mer komplex, svår och osäker än tolkningen och extrapoleringen av andra toxicitetsstudier. Alla kända humanteratogener är dock också teratogena hos mus, råtta och/eller kanin. Överensstämmelsen är störst när det finns positiva resultat från mer än ett djurslag. Mus och råtta har i flera analyser visats vara "bäst" på att förutsäga teratogen effekt hos människa, då de tillsammans reagerar på 80-85 % av de kända humanteratogenerna. Kaniner fungerar i detta avseende sämre - de svarar på ungefär 60% av humanteratogenerna. Samma typ av missbildningar som setts med kända humanteratogener har gått att framkalla hos ett eller flera species. Det finns dock inget species med perfekt prediktiv förmåga för en specifik typ av missbildning som setts hos människa. I allmänhet går det inte att extrapolera specifika typer av missbildningar från ett species till ett annat (inklusive människa) med någon större säkerhet. Studier på apa borde av taxonomiska skäl vara att föredra, men det har visat sig att apor inte svarar alls på flera kända humanteratogener.

Relativt många läkemedel förmodas, på bättre eller sämre epidemiologiska grunder, vara icke-teratogena hos människa. Trots detta är flera positiva i djurförsök, i synnerhet hos mus och råtta. Detta pekar på en viss "överprediktion" av teratogen potential.

Negativa resultat i Segment II-studier utgör ingen garanti för att ett läkemedel är icke-teratogent hos människa. Likaså är positiva resultat vid höga doseringar i djurförsök inte nödvändigtvis prediktiva för teratogenicitet hos människa vid terapeutisk dosering.

Anledningarna till variationen i teratogent svar mellan olika djurslag och människa är till stor del okända. Bättre förutsägelser av läkemedels teratogena potential kan inte förväntas förrän vi fått bättre kunskaper om mekanismerna för teratogenes. Det testprogram för reproduktionstoxikologi som använts sedan 60-talet verkar dock, trots extrapoleringssvårigheterna, fungera väl, eftersom inga nya Neurosedyn-katastrofer inträffat. 

Kerstin Bergman